长期以来，传统尺寸排阻色谱（SEC）在表征复杂结构、高分子量及多组分体系等“非典型”的分子时存在明显的局限性。尤其是面对抗体偶联药物（ADC）、核酸药物、多特异性抗体、糖基化蛋白、去垢剂胶束包裹的膜蛋白及PROTAC等新一代生物药等复杂样品，基于“相对法”原理的传统SEC方法往往难以获得真实可靠的分子量信息，因为其通过比对未知样品与标准蛋白的洗脱体积推算分子量的方法依赖于一个关键假设：样品分子与标准品具有相似的流体力学行为，即近似球状、构象稳定、且与固定相无特殊吸附。

而新一代SEC-MALS（尺寸排阻色谱-多角度静态光散射联用）技术由于无需依赖标准品，不预设分子形态，直接基于光散射的第一性原理，可在洗脱过程中实时测定分子的绝对分子量。近年来已经被业界广泛视为大分子绝对表征领域的“黄金标准”，尤其适用于结构复杂、修饰多样的新型生物药。

图1. 常见的“非典型”分子

SEC-MALS 是什么：三重检测器如何协同"称"出绝对分子量

基本组成：SEC-MALS并非单一检测方法，而是一套由多种检测器联用、协同完成绝对分子表征的完整分析系统。其核心组件包括三个层面：

图2. SEC-MALS的基本组成

核心原理：SEC-MALS的物理基础来自静态光散射理论。当一束激光照射到溶液中分子时，分子会向各个方向散射光线。

图3. 光散射检测示意图

静态光散射的理论基础，源于瑞利散射框架下的德拜方程（Debye Equation）：

在SEC分离后的稀释体系中，操作得以简化：将多角度测得的瑞利比R(θ)与同步检测的浓度c代入模型，并将角度外推至θ→0（此时形状因子P(0)=1），即可直接解得重均分子量M_w。全过程仅需输入样品专属的折射率增量dn/dc，即该分子在特定溶剂中的“光学指纹”。

进一步利用P(θ)的角度依赖性即可反推旋转半径R_g。绘制R_g对M的双对数图，便可通过斜率直观判定分子构象：紧致球状（≈0.33）、无规线团（≈0.5-0.6）或棒状/纤维（≈0.8-1.0），从而实现构象的一并解析。

什么场景用SEC-MALS

简言之，对于非典型球蛋白或具有复杂构象的样品，SEC-MALS是不可或缺的表征手段。

代表性实战案例：它到底帮你解决了什么问题

案例一：糖基化修饰蛋白表征

痛点：在分析某重组表达蛋白时，SDS-PAGE结果显示条带呈弥散状，表观分子量分布在30-55 kDa范围内，显著高于其理论分子量（21.96 kDa）。由于传统SEC与LC-MS均无法准确测定其真实分子量，难以判定样品究竟是糖基化单体，还是同时含有糖基化单体与二聚体的混合物。

采用SEC-MALS对该样品进行绝对分子量表征，结果明确：

1.确认样品均一性：在主峰区间测得绝对分子量M_w为42.96 kDa，且M_w/M_n＜1.05，证实了该蛋白样品的均一性，能满足X-ray结构研究的质量要求。

2.量化糖基化程度：利用UV/RI双通道信号比，精确拆分蛋白与糖链的质量分数，明确了表观偏差源自糖基化修饰（21.65 kDa）和蛋白为单体状态 (21.31 kDa)。

图4. 经SEC-MALS分析，该糖蛋白为均一单体，满足X-ray结构研究要求

案例二：去垢剂胶束包裹的膜蛋白分析

痛点：某纯化后的膜蛋白在传统SEC上出峰位置对应的表观分子量远大于序列预测值64.4 kDa，且由于Buffer中存在去垢剂，无法利用质谱（Mass Spectrometry）对其进行检测。团队无法判断纯化得到的膜蛋白的聚集状态和均一性。

采用SEC-MALS对该样品进行绝对分子量表征，结果明确：在主峰区间测得绝对分子量 M_w为209.7 kDa，且M_w/M_n＜1.05，证实了该蛋白样品的均一性（为单一的去垢剂胶束包裹的多聚体或去垢剂胶束包裹的单聚体）；利用UV/RI双通道信号比，精确拆分膜蛋白（64.03 kDa）与去垢剂胶束（145.67 kDa）的质量分数，精准检测出该去垢剂胶束包裹的膜蛋白为单聚体。证实制备的该膜蛋白样品能满足Cryo-EM结构研究的质量要求。

图5. 经SEC-MALS分析，该膜蛋白为均一单体，满足Cryo-EM结构研究要求

案例三：RNA聚集与稳定性分析

痛点：在研究某RNA分子与靶标蛋白的相互作用时，无法获得理想的实验数据（如亲和力），其可能原因是RNA分子聚集导致无法与靶蛋白结合。而传统SEC因电荷效应、构象偏差和吸附问题无法准确表征RNA分子。

采用SEC-MALS对该样品进行绝对分子量表征，结果明确：测得各洗脱组份的绝对分子量 M_w和M_w/M_n值，精准掌握各洗脱组份的聚集状态，通过分析考察浓度和时间对RNA分子的聚集状态的影响，为后续实验确定了最佳的反应浓度、时间和缓冲液组份。

图6. SEC-MALS对RNA聚集状态分析

除上述案例外，维亚生物SEC-MALS还广泛应用于PEG化蛋白修饰分析、抗体偶联药物（ADC）药物抗体比（DAR）测定、蛋白-DNA复合物分析等复杂体系研究。无论是修饰分子的组成解析、复合物化学计量比测定，还是聚集状态与均一性评价，我们均能够提供传统SEC难以获得的绝对表征信息。

维亚生物SEC-MALS平台：不止于绝对分子量表征，更为高级结构决策提供关键数据

维亚生物分析团队配备Wyatt Technology出品的当前全球最顶尖的DAWN^®系列18角度MALS检测器及配套RI/UV联用流路，由ASTRA^®专业分析软件驱动数据采集与建模。但设备只是底座——真正让这项技术服务产生价值的是三层能力：

1.方法适配能力：你不用先"懂MALS"再来找我们

拥有超过五年、3000余个样品的丰富检测经验，覆盖膜蛋白、糖蛋白、抗体、PROTAC、核酸及核酸-蛋白复合物等多种分子类型。在此基础上，我们已针对dn/dc取值、流动相兼容性与浓度优化建立了标准化工作流，从而确保实验条件从第一天起就准确可靠，有效避免信号异常或柱损伤等常见问题。检测与数据分析最快可在2天内完成。

图7. 维亚生物SEC-MALS平台业务能力

2.从“一个数”到“一个可行动结论”

单次SEC-MALS运行可同步交付：

· 绝对分子量 Mw（各峰+沿色谱切片分布）

· 多分散指数（Ð=M_w/M_n)：判断样品均一性

· R_g（构象/紧致度判断）

· 结合比例/计量比（UV+RI双通道反推；适用于糖基化、PEG化、ADC-DAR、蛋白-核酸）

· 聚集百分比定量（优于传统SEC峰面积%——基于绝对质量进行计算，而非依赖相对UV响应信号）

3.与上游/下游研发链条打通

维亚生物拥有覆盖“蛋白制备—结构解析（X-ray/Cryo-EM）—生物物理表征（SPR/HDX-MS/ASMS）—CMC分析”的一站式平台。在此体系下，SEC-MALS不再只是一份检测报告，而是贯穿早期药物开发全链条的底层技术支撑：从高质量靶点蛋白的获取，到PCC阶段关键分子参数的决策依据，再到后期制剂筛选、工艺可比性研究及放行检测中不可或缺的正交手段。尤其在处理结构复杂的“非标”分子、传统表征遭遇瓶颈时，我们能为您提供确凿的“黄金标准”数据。

图8. DAWN检测器及检测范围

参考资料与拓展阅读：

Technology Networks. Technology Networks - The Online Scientific Community
Nature Reviews Methods Primers. Size-exclusion chromatography with multi-angle static light scattering. 2025. 5, Article 40.
Institute for Protein Design. De Novo Design of Membrane Proteins – Institute for Protein Design

如需了解更多SEC-MALS检测服务详情，欢迎联系我们的专家团队：info@vivabiotech.com。