知道一个分子能与靶点结合，并不意味着知道它究竟结合在哪里。

光亲和标记（Photoaffinity Labeling, PAL）已成为药物发现中揭示分子识别最有力的化学生物学技术之一。这项技术能够在近天然条件下通过共价结合捕获瞬时的配体-蛋白质复合物，从而保留那些在纯化或分析过程中可能解离的复合物形态。对于研究弱结合，动态结合以及使用传统生物物理或生物化学方法难以表征的蛋白质复合物，PAL尤其有价值。结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等现代分析技术，PAL 能够为发现靶蛋白，确定配体结合位点，以及表征蛋白质相互作用网络提供捷径。

PAL与传统共价标记有何不同？

传统共价标记策略通常依赖具有反应活性的残基的空间邻近性（赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸），或亲电性弹头来实现分子间的交联。与上述传统策略不同的是，PAL通过光诱导激活配体上的光反应基团以产生高活中间态。该中间态可与更多位于结合位点的氨基酸残基（包括不含亲核基团的氨基酸残基）发生反应，从而形成不可逆的共价结合。正因为这种"反应性驱动"而非"位点依赖"的交联方式，PAL可以捕捉到可逆配体的结合位点，也能有效表征传统共价策略无法覆盖的低亲和力相互作用。

光亲和探针的开发流程

光亲和探针（photo-affinity probe）的开发始于对配体-靶标体系的分析。在大多数需要PAL技术参与的案例中，结合位点或结合相互作用的信息非常有限。一组活性衍生物化合物及其构效关系（SAR）的信息，有助于理解靶标结合的结构特征，为合理的探针设计提供结构基础，并降低影响靶标结合的风险因素。综合以上信息进行评估后，就可以在配体上确定一个或多个位点，用来衔接连接臂和光反应基团。

连接臂的性质，包括连接化学、位阻效应、长度、灵活性、支化结构、稳定性和溶解性，均需仔细考虑，以保证在维持配体结合的同时实现高效的标记和下游检测。常见的光反应基团，包括二苯甲酮（benzophenone）、双吖丙啶（diazirine）和叠氮（azide）官能团，均能够在光活化后通过共价键捕获配体-靶标相互作用。在实操中可根据其靶标标记的适用性进行选择。

此外，报告标签的引入可以促进标记靶标的检测和分析。可用的报告基团包括用于亲和富集的生物素、用于可视化的荧光团，以及可通过点击化学实现后续功能化的炔基。在研究过程中建议设计多个具有良好预期特性的探针结构，同时评估其合成路线的可行性，以便最大限度地控制时间和成本。

探针合成完毕后，需要从光交联条件优化开始对探针进行一系列的生物学评估，以达成在控制非特异性反应的同时，最大化选择性交联的目标。标记的靶标可通过质谱（MS）或通过引入的报告标签进行检测。基于报告标签的检测方法，可以通过适当的反应和检测方法对标记蛋白进行可视化或富集。

对照实验对于验证标记特异性至关重要。这些实验包括：不加紫外光照射，验证交联是否依赖光激活；不加探针，评估本底标记水平；使用对照化合物，确认标记信号确实来自探针与靶标的特异性结合。

确认配体结合位点

光亲和标记已成为确定配体结合位点和阐明分子作用机制的不可或缺的工具，它是一种与X射线晶体学、冷冻电子显微镜（Cryo-EM）、核磁共振（NMR）波谱学和计算建模互补的实验技术。当配体结合复合物的高分辨率结构不可获得，或配体结合诱导构象变化使结构测定复杂化时，识别光交联残基的位置可为配体结合口袋的位置提供实验证据和宝贵的结构信息。结合位点信息可进一步作为结构导向优化、分子动力学（MD）模拟和分子对接的实验约束条件。

光亲和标记突破了传统结构方法在难成药靶点中的技术限制，已成功应用于膜蛋白、离子通道、G蛋白偶联受体、转运蛋白以及本质动态的蛋白质复合物等治疗靶点的药物研发项目中。

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总结

合成化学、光反应探针设计、定量化学蛋白质组学和高分辨率质谱的持续进步，已将光亲和标记从一项专门的生化技术转变为一个广泛应用于化学生物学和药物化学机理研究的平台。近年来，光亲和标记越来越多地应用于新兴治疗模式，如大环肽、靶向蛋白降解剂、分子胶和共价抑制剂，为难以通过其他方法捕获的复杂三元或瞬时相互作用提供了机理层面的见解。随着这些技术的不断成熟，光亲和标记有望在确定配体结合位点、验证生理相关系统中的靶标结合，以及推动新一代治疗药物的设计中发挥日益重要的作用。

维亚生物的科学团队通过跨领域整合药物化学、化学生物学、蛋白质科学、质谱分析和结构生物学，为全球客户提供光亲和标记解决方案以及一体化药物发现服务。从探针设计与合成，到紫外诱导标记和结合位点残基鉴定，最终获得分子结合位点相关的结构信息，并用于苗头化合物验证和先导优化工作。凭借在多种靶点类型和不同化学分子模态方面的丰富经验，维亚持续开发先进技术平台用以支持合作药企的药物发现服务需求。

参考文献
1. Homan, R.A., Lapek, J.D., Woo, C.M. et al. Photoaffinity labelling with small molecules. Nat Rev Methods Primers 2024 4, 30.
2. Cao, L., Wang, L. Biospecific Chemistry for Covalent Linking of Biomacromolecules. Chem. Rev. 2024 124, 8516–8549.
3. Parker, C. G.; Galmozzi, A.; Wang, Y.; Correia, B. E.; Sasaki, K.; Joslyn, C. M.; Kim, A. S.; Cavallaro, C. L.; Lawrence, R. M.; Johnson, S. R.; et al. Ligand and Target Discovery by Fragment-Based Screening in Human Cells. Cell 2017 168 (3), 527–541.
4. Lisauskaite, M., Nixon, G. L., Woodley, C. M., Berry, N. G., Coninckx, A., Qie, L. C., Leung, S. C., Taramelli, D., Basilico, N., Parapini, S., et al. Design, synthesis and modelling of photoreactive chemical probes for investigating target engagement of plasmepsin IX and X in Plasmodium falciparum. In RSC Chem. Biol. 2024 5, 19–29.
5. Soday, L., Seripracharat, C., Gray, J. L., Luz, A. F. S., Howard, R. T., Singh, R., Burden, T. J., Bernardini, E.; Mateus-Pinheiro, M., Petersen, J., et al. Discovery and Validation of a Novel Class of Necroptosis Inhibitors Targeting RIPK1. ACS Chem. Biol. 2025, 20 (7), 1527–1543.

作者贡献
· 丁克家 撰写初稿（主导），撰写-审阅与编辑（主导），可视化（平等贡献）; 
· 卞若瑾 撰写-审阅与编辑，可视化（平等贡献）