利用冷冻电镜（cryo-EM）解析小分子量蛋白的高分辨率结构，长期以来都是结构生物学领域的一大挑战。为突破这一技术瓶颈，维亚生物冷冻电镜、抗体研发、AIDD/CADD、MARS（Multi-Modality AI-Rooted Solutions）及蛋白与结构研究等多个平台协同开发了CryoFAST，将配体兼容型Fab的发现与优化、生化筛选、复合物构建和高分辨率cryo-EM解析整合为一体，形成了一套系统化的技术工作流程。以分子量约20kDa的人源IL-4Rα胞外结构域作为概念验证靶点，研究团队最终获得2.74Å高分辨率结构，展示了CryoFAST在低分子量蛋白结构解析中的应用潜力，也为50kDa以下药物靶点的结构研究及基于结构的药物研发（SBDD）提供了新的技术路径。

目前，相关研究成果已以预印本形式发布于bioRxiv，论文题为“CryoFAST: A Fab-Aided Cryo-EM Workflow for High-Resolution Structure Determination of Sub-50-kDa Protein Targets”。

小蛋白的“尺寸瓶颈”：为何高分辨率cryo-EM解析仍是难题？

随着直接电子探测器、电子显微镜硬件及图像处理算法的持续进步，单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）已成为结构生物学研究和SBDD的重要工具。然而，随着目标蛋白分子量减小，颗粒图像的信噪比随之降低，使颗粒识别、取向确定及三维重构面临更大挑战。尤其对于50kDa以下的小分子量蛋白，获得高分辨率结构仍具有较高的技术门槛。而许多具有重要药物开发价值的酶、细胞因子、受体胞外结构域及蛋白–蛋白相互作用模块，恰恰处于这一分子量范围。

为克服这一限制，研究人员已开发出多种辅助策略，包括利用Fab、纳米抗体（nanobody）及工程化蛋白支架等增加复合物的有效尺寸，改善颗粒识别与取向确定。然而，对于SBDD而言，单纯让蛋白“变大”远远不够：辅助结合分子还需尽可能避开潜在的药物结合位点，同时减少对靶蛋白天然构象的扰动，从而确保解析所得结构能够为后续药物设计提供可靠的结构依据。

CryoFAST：不止于“增重”，构建面向SBDD的一体化工作流

CryoFAST的核心理念，并非简单地为小分子量靶蛋白寻找一个能够结合的Fab，而是从药物发现的实际需求出发，将结合表位、配体兼容性、复合物稳定性及cryo-EM结构解析适用性纳入统一的设计、筛选与优化流程。

首先，通过噬菌体展示筛选和/或AI辅助设计获得多个候选Fab，优先选择与配体结合相兼容的结合模式，并借助计算方法进一步优化；随后，结合生化表征对候选Fab进行系统评估，筛选出配体兼容性好、结合能力强且稳定性高的优质候选分子；最后，组装Fab–靶蛋白复合物，开展cryo-EM样品制备、数据采集、图像处理及结构验证，实现从Fab发现到高分辨率结构解析的完整技术流程。

通过这一整合策略，Fab不再只是增加颗粒尺寸的辅助工具，更成为连接小分子量蛋白高分辨率结构解析与SBDD应用的重要桥梁。

图1：CryoFAST工作流程示意图（来源于本次研究）

IL-4Rα概念验证：从Fab理性优化到2.74Å高分辨率结构解析

研究团队选择分子量约20kDa的人源IL-4Rα胞外结构域作为概念验证靶点。在Fab筛选过程中，不仅评估候选抗体与IL-4Rα的结合能力，还同步检测其与预先形成的IL-4Rα–IL-4复合物的结合情况，从而优先筛选出能够识别靶蛋白且不干扰天然配体结合的候选Fab。

获得初始Fab后，团队进一步结合AlphaFold2-Multimer结构预测、100ns分子动力学模拟及基于结合界面的计算辅助设计，对Fab进行理性优化，共设计并获得23个Fab变体。经过筛选与验证，最终优选出的Fab-16对游离IL-4Rα及IL-4Rα–IL-4复合物均表现出显著提升的表观结合能力，同时保持良好的配体兼容性，为后续高分辨率cryo-EM结构解析奠定了基础。

图2：候选Fab的配体兼容性及表观结合能力比较（来源于本次研究）

随后，研究团队将IL-4Rα ECD、Fab-16及抗Fab纳米抗体组装成稳定复合物，成功解析了整体分辨率达2.74Å的cryo-EM结构，清晰揭示了IL-4Rα与Fab-16结合界面的关键侧链相互作用。

进一步的结构分析表明，Fab-16的结合表位与IL-4的正构结合位点在空间上相互分离。将CryoFAST解析的IL-4Rα结构与已报道的晶体结构（PDB：6WGL）进行叠合，主链均方根偏差（RMSD）仅为0.858Å，表明Fab-16的结合未引起IL-4Rα明显的整体构象变化。这一结果与前期配体兼容性实验相互印证，进一步支持了Fab-16作为cryo-EM辅助结合分子的适用性。

这一概念验证不仅展示了CryoFAST在小分子量蛋白高分辨率结构解析中的技术可行性，也为未来开展小分子、多肽等配体的共结构研究及SBDD应用奠定了基础。

图3：IL-4Rα CryoFAST复合物的cryo-EM结构及比较（来源于本次研究）

多平台协同创新，拓展小分子量蛋白结构解析的边界

CryoFAST的成功开发，充分体现了维亚生物多技术平台协同创新的优势。其中，生物学平台负责Fab的发现与开发；AIDD/CADD及MARS平台提供结构预测、分子模拟与AI辅助设计支持；蛋白与结构研究平台负责高品质靶蛋白制备；冷冻电镜（cryo-EM）平台则统筹整体技术流程，并负责复合物评价及高分辨率cryo-EM结构解析。各平台紧密协作，形成了从Fab发现、设计优化到结构解析的一体化技术体系。

目前，CryoFAST的技术策略已应用于多个内部小分子量蛋白研究项目，并成功获得高分辨率cryo-EM结构。本研究以IL-4Rα为代表性案例，系统展示了CryoFAST在突破小分子量蛋白结构解析瓶颈方面的技术潜力。

展望未来，随着AI驱动的从头抗体设计（de novo antibody design）及cryo-EM技术的持续发展，CryoFAST有望进一步拓展至更多传统上难以解析的小分子量药物靶点，为SBDD提供更加灵活、高效的技术解决方案。

如需了解更多论文内容，请查看：
Li, X., Deng, S., Li, W., Qian, Y., Li, Y., Du, J., Li, Le and Qian, D. (2026). CryoFAST: A Fab-Aided Cryo-EM Workflow for High-Resolution Structure Determination of Sub-50-kDa Protein Targets. [online] doi:10.64898/2026.10.07.757472.

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